Proteine in der Zelle orten: Neue Vektoren erleichtern die Lokalisierung.
Die genaue Ortung von interessanten Proteinen (Proteins of Interest, POI) innerhalb der Zelle ist oft unerlässlich, um deren physiologische Funktion zu ergründen. Die gängigste Methode einer solchen in-vivo-Lokalisierung stellt die Verbindung des POIs mit Fluoreszenzmarkern dar, welche als Fusionskonstrukt in die Zellen transformiert und dort exprimiert wird. Eine präzise Lokalisation des POI in einzelnen Zellkompartimenten erfordert zudem die Co-Transformation von entsprechenden Organellenmarkern. Eine solche Co-Transformation zweier verschiedener Vektoren in ein und dieselbe Zelle kann bei niedrigen Transformationsraten eine große Hürde für eine erfolgreiche Lokalisierung des zu ortenden POIs sein. Wissenschaftler/innen des IPB haben nun verschiedene Transformationsvektoren mit allen grundlegenden Organellenmarkern entwickelt, in die man mit Hilfe der Golden-Gate-Methode in einem einzigen Klonierungsschritt die gewünschten Gene (Genes of Interest, GOI) einfügen und mit einer GFP-Sequenz versehen kann. Auf diese Weise können mit nur einer Transformation fluoreszierende POI-GFP-Fusionsproteine und die eingesetzten Organellenmarker in der Zelle gemeinsam exprimiert werden. Die mCherry-fusionierten Organellenmarker umfassen Strukturen der Plasmamembran, des Tonoplasten, des Zellkerns, des endoplasmatischen Retikulums, des Golgi-Apparats, der Peroxisomen, Plastiden und Mitochondrien. Vieler dieser Markersequenzen wurden von bereits etablierten Markersätzen abgeleitet, andere haben die Hallenser Wissenschaftler durch die Verwendung von anderen Proteinen verbessert und optimiert. Die entwickelten Vektoren eignen sich für Lokalisierungsstudien in isolierten Protoplasten und für die transiente Transformation von Nicotiana benthamiana-Blättern. Ihre Funktionalität wurde anhand zweier Enzyme demonstriert, die an der Biosynthese von Jasmonsäure beteiligt sind. Die Enzyme finden sich entweder in den Plastiden oder in Peroxisomen.
