Bioorganische Chemie

Hier stellt Pascal Püllmann seine Forschungsprojekte vor. 

In der Katalyse gibt es Metall- und Organokatalysatoren. Ein weiterer Bereich der Katalyse ist die Biokatalyse. Bei der Biokatalyse werden natürliche Proteine eingesetzt, um chemische Reaktionen zu katalysieren. In unserem Körper und in jedem lebenden Organismus laufen Tausende von Reaktionen gleichzeitig ab – fast alle werden von Proteinen katalysiert. Katalytisch aktive Proteine sind Enzyme. Die Komplexität und die Notwendigkeit von Präzisionsarbeit im lebenden Organismus verdeutlichen bereits die Stärken von enzymkatalysierten Reaktionen: die unübertroffene Selektivität, d. h. Substratspezifität, und die Regio-, Chemo- und Stereoselektivität der Umsetzung. Außerdem werden Enzyme aus erneuerbaren Quellen hergestellt, sind biologisch abbaubar und funktionieren in Wasser bei neutralem pH-Wert.

Wir wollen unser chemisches Wissen nutzen, um Enzyme für chemisch anspruchsvolle oder sogar chemisch unmögliche Reaktionen einzusetzen.

Obwohl die Natur eine beeindruckende Vielfalt an Enzymen bereithält, müssen die Enzyme oft an die gewünschte Eigenschaft "angepasst" werden. In der Natur haben sich die Enzyme in Millionen von Jahren in Richtung der Aktivität, Stabilität oder sogar Katalyse entwickelt, die für das Überleben der Zelle erforderlich sind: die darwinistische Evolution.

Die Durchführung dieser Evolution im Labor wurde mit dem Nobelpreis für Chemie 2018 für Frances Arnold gewürdigt und wird als gerichtete Evolution bezeichnet. Schauen Sie sich ihren Nobelpreisvortrag an, um einige Einblicke zu erhalten. In der Abbildung ist der allgemeine Arbeitsablauf der gerichteten Evolution dargestellt. Das Gen, das dem gewünschten Protein entspricht, wird durch zufällige oder semi-rationale Methoden mutiert. Die erzeugte Mutantenbibliothek wird in Zellen transformiert, die die Gene exprimieren und so die entsprechenden Proteine produzieren. Die Varianten werden dann auf eine veränderte Funktion wie erhöhte Aktivität, veränderte Selektivität oder Stabilität untersucht. Der Wissenschaftler entscheidet, in welche Richtung die Enzyme weiterentwickelt werden sollen. Daher auch der Begriff: Gerichtete oder auch gelenkte Evolution.

Für die einfache Erstellung von Bibliotheken mit Sättigungsstellen an mehreren Positionen gleichzeitig in einem Schritt und an einem Tag haben wir eine Golden Gate-basierte Technik namens Golden Mutagenesis entwickelt (Scientific Reports 9, 2019). Golden Mutagenesis ist außerordentlich effizient und führt zu bis zu 100 % korrekt zusammengesetzten Plasmiden. Gemeinsam mit der AG Bioinformatik & Forschungsdaten (geleitet von Steffen Neumann) haben wir ein Online-Tool entwickelt, das ein einfaches und schnelles Primer-Design ermöglicht. Sogar die Sequenzierergebnisse können hochgeladen werden, um die Diversität der erstellten Bibliothek zu bestimmen. Dieses Tool ist für jeden frei verfügbar. Siehe hier. Alle entwickelten Plasmide sind bei AddGene erhältlich.

Der Engpass aller Bemühungen für die gerichtete Evolution ist das Screening der Proteinvariantenbibliothek. Es wurden viele Techniken zur schnellen Untersuchung großer Bibliotheken entwickelt. Die meisten von ihnen sind jedoch enzym- oder substrat- bzw. produktabhängig. Wir haben eine vielseitige Hochdurchsatz-GC-MS-Technologie namens MISER GC-MS entwickelt, die eine Messung der Analyten alle ~30 s ermöglicht (ChemCatChem, 12, 2021). Da die Detektion durch MS erfolgt, haben wir das System weiter ausgebaut, um bis zu sechs Produkte parallel zu screenen, von denen sich einige nur durch unterschiedliche Fragmentierungsmuster unterscheiden. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, eine kleine Bibliothek von nur 900 Transformanten zu screenen, um Variationen in Substratspezifität, Aktivität und Regioselektivität zu erkennen (Cat. Sci. Technol., 11, 2021).

Die AG Weissenborn ist Mitglied im

• Leibniz Research Cluster Bio/synthetische multifunktionale Mikroproduktionseinheiten - neuartige Wege der Wirkstoffentwicklung und
• MiKat - Centre for Biocatalysis