Mix die Sequenzen! Bessere Enzymexpression durch Gene-Shuffling.
Neues von der UPO-Front! Unspezifische Peroxygenasen (UPOs) pilzlichen Ursprungs werden wegen ihrer Fähigkeit zu vielfältigen Hydroxilierungsreaktionen gerne als Biokatalysatoren eingesetzt. Die Suche nach neuen UPOs mit gewünschten Substratspezifitäten für spezielle Syntheseprozesse steht deshalb gerade weit oben auf der Agenda der Synthesechemiker. Die Produktion der gewünschten Enzyme in Hefen erweist sich jedoch als schwierig, da UPOs aus verschiedenen Gründen schwer zu exprimieren sind.
Pascal Püllmann und Martin Weissenborn vom IPB haben jetzt Abhilfe geschaffen. Mit dem von ihnen konzipierten Gene-Shufflingsystem kann man in kurzer Zeit die besten genetischen Voraussetzungen für die Expression von Enzymen herausfinden. Für einen ersten Test des Systems kombinierten die Hallenser Wissenschaftler die Gene von drei bekannten UPOs mit jeweils elf Promotor- und 17 Signalpeptidsequenzen und schleusten die entstandenen Konstrukte in die industriell genutzte Expressionshefe Pichia pastoris ein. Die resultierenden Bibliotheken wurden anschließend mit kolorimetrischen Screening-Assays auf UPO-spezifische Aktivitäten untersucht. So konnten die besten Promotor-Signalpeptid-Kombinationen ermittelt werden, welche zu guten UPO-Ausbeuten in der Hefeexpression führten.
Die Probe aufs Exempel erfolgte dann mit zwei neuen UPOs, die bisher noch nicht in Hefe exprimiert werden konnten und anschließend mit anderen Enzymklassen wie Lipasen oder Laccasen. Insgesamt wurden auf die Art und Weise rund 3200 Pichia-Transformanten von acht verschiedenen Enzymen gescreent und die besten Promotor-Signalpeptid-Kombinationen unter verschiedenen Anzucht- und Induktionsbedingungen untersucht. In den meisten Fällen sorgte diese Selektion der besten Expressionskonditionen für vielversprechende Ausbeuten in den produzierten Enzymmengen. Das Wissen der Hallenser Chemiker soll nun auch anderen zugutekommen. Deshalb stellen Püllmann und Weissenborn alle Plasmide auf der Plasmidarchiv-Plattform Addgene allen Wissenschaftlern zur Verfügung.
