Golden Gate und Sekretion: Begehrte Enzyme in Hefe herstellen.
Unspezifische Peroxygenasen (UPOs) können ein breites Spektrum an Substraten hydroxylieren und sind daher als Biokatalysatoren zur Verkürzung von industriellen Synthesewegen von enormem Interesse. Die Enzymklasse kommt natürlicherweise in Höheren Pilzen vor, die sich zunehmend als vielversprechende Quelle von verschiedenen UPOs erweisen. Nach vermehrten Sequenzierungsprojekten der Höheren Pilze in jüngster Vergangenheit, konnten bereits über 4000 potentielle Peroxygenasegene identifiziert werden. Die heterologe Expression der begehrten Enzyme - beispielsweise in Hefen - erweist sich jedoch als äußerst schwierig: Die Proteine sind stark glykosyliert und weisen eine Häm-Thiolat-Gruppe als aktives Zentrum auf. Wissenschaftler/innen des IPB haben jetzt mit Partnern der MLU ein modulares Golden-Gate-basiertes Sekretionssystem entwickelt, das die Expression von aktiven UPOs in Hefe, inklusive deren einstufige Reinigung und Aktivitätsprüfung, ermöglicht.
Dafür wurden 17 verschiedene Signalpeptidsequenzen mit den Genen von jeweils acht UPOs und sieben C-terminalen Proteintags zur späteren Aufreinigung und Split-GFP-Detektion miteinander kombiniert. Zwei der eingesetzten UPO-Gensequenzen waren allein aus Genom- und Sekretomdaten abgeleitet und zuvor noch nicht als Peroxygenasen charakterisiert worden. Die UPO-Konstrukte wurden zunächst erfolgreich in Bäckerhefe exprimiert und auf Aktivität und Substratspezifität getestet. Anschließend übertrugen die Hallenser Wissenschaftler das gesamte Sekretionssystem auf die biotechnologisch genutzte Expressionshefe Pichia pastoris, was zu hervorragenden Ausbeuten führte.
UPOs wurden erstmals zu Beginn des Milleniums entdeckt. Sie katalysieren sehr effizient eine Vielzahl an Hydroxylierungsreaktionen und benötigen ausschließlich Wasserstoffperoxid als Cosubstrat. Ihr Einsatz als Biokatalysatoren in ausgesuchten Synthese- und Biotechnologieverfahren wird jedoch durch ihre suboptimalen Regio- und Enantioselektivitäten gegenüber bestimmten Substraten limitiert. Zudem gibt es zurzeit nur sehr wenige verfügbare UPOs, was die Suche nach einem geeigneten Katalysator für die gewünschte Reaktion erschwert. Mit ihrer Studie legen die Hallenser Chemiker den Grundstein für eine bessere Sichtung und Verwertung des enormen Potentials von bisher nicht genutzten oder unbekannten UPOs aus dem Reich der Pilze.
