Optimierte Genschere für Pflanzen.
Die Genom-Editierung mit CRISPR/Cas hat sich in kürzester Zeit als schnelle und wirkungsvolle Methode zur gezielten Änderung von Genen etabliert. Es gibt jedoch viele Varianten dieses molekularen Werkzeugs und reichlich Raum für Optimierung bei der Anwendung in verschiedenen Organismen. Wissenschaftler/innen des KIT Karlsruhe und des IPB ist es jüngst gelungen ein Cas-Enzym für die Nutzung in Pflanzen deutlich effizienter zu machen.
Bei der Genom-Editierung mittels CRISPR/Cas-Systemen wird eine Cas-Endonuklease von einer guide-RNA zur entsprechenden DNA-Zielsequenz im Organismus geleitet. Dort schneidet die Endonuklease den DNA-Doppelstrang enzymatisch. Durch die darauffolgenden zelleigenen Reparaturprozesse, die jedoch oft fehlerbehaftet sind, kann das Gen funktionsunfähig gemacht werden. Alternativ kann durch Steuerung der Reparaturmechanismen sogar eine erwünschte Mutation eingefügt und so die Genfunktion verändert werden. Im Gegensatz zur weitverbreiteten Cas9-Endonuklease, die beide DNA-Stränge an der gleichen Stelle schneidet und blunt ends („stumpfe Enden“) erzeugt, hinterlässt die Cas12a-Endonuklease sticky ends („klebrige Enden“). Das heißt, an der Schnittstelle ist ein Strang des DNA-Doppelstrangs wenige Nukleotide länger als der andere. Für verschiedene Anwendungen ist das CRISPR/Cas12a-System geeigneter, auch weil sticky ends einfacher wieder zusammengefügt werden können. Die kurzen einsträngigen Überhänge stehen nämlich für die Bindung passender DNA-Sequenzen zur Verfügung - damit kann auf Reparaturprozesse noch besser eingewirkt werden.
In Pflanzen jedoch konnte Cas12a bisher noch nicht erfolgreich verwendet werden. Zum einen herrschen bei der Pflanzenanzucht meist Temperaturen, die für das Enzym zu niedrig sind, um optimale Aktivität zu entfalten. Zum anderen arbeitete das Enzym nicht effizient genug, vor allem bei schwer zugänglichen Gensequenzen wie sie im Heterochromatin, einer dicht um Proteine gepackten und verdrillten Form der DNA, vorkommen. Während die Karlsruher Wissenschaftler/innen in der Vergangenheit eine temperaturtolerante Cas12a-Variante herstellen konnten, die auch bei Gewächshausbedingungen von 22°C aktiv ist, haben die Hallenser Wissenschaftler/innen bereits Erfahrungen darin, die Effizienz von Cas9 zu steigern. In einer früheren Arbeit hatten sie gezielte Veränderungen in der codierenden Sequenz für Cas9 vorgenommen. Durch den Einbau von zwei Nuklearen Lokalisationssignalen sowie 13 Introns konnten sie die Endonuklease so verbessern, dass sie bei Anwendung in Arabidopsis eine Mutationshäufigkeit von 70-100% hervorbrachte. Die Introns, nicht-codierende Sequenz-Einschübe, sorgen dabei vermutlich für eine deutlich gesteigerte Expression der Nuklease.
In der vorliegenden Studie haben beide Wissenschaftlerteams nun ihre jeweiligen Optimierungsansätze kombiniert auf Cas12a angewendet und waren erfolgreich. Gegenüber der temperaturtoleranten Cas12a-Variante ohne Veränderungen zeigte eine Variante mit 10 Introns eine deutlich gesteigerte Editierungseffizienz in Arabidopsis. Besonders für schwer editierbare Zielsequenzen wurde eine verbesserte Wirkung erzielt. Die Autoren stellen ihr weiterentwickeltes Cas12a-Konstrukt über Addgene zur Verfügung.
Publikation:
Schindele, P., Merker, L., Schreiber, T., Prange, A., Tissier, A. & Puchta, H. 2022. Enhancing gene editing and gene targeting efficiencies in Arabidopsis thaliana by using an intron‐containing version of ttLbCas12a. Plant Biotechnology Journal. Available at: http://dx.doi.org/10.1111/pbi.13964
Frühere Publikationen:
Grützner, R., Martin, P., Horn, C., Mortensen, S., Cram, E. J., Lee-Parsons, C. W. T., Stuttmann, J. & Marillonnet, S. 2021. High-efficiency genome editing in plants mediated by a Cas9 gene containing multiple introns. Plant Communications 2:100135. Available at: http://dx.doi.org/10.1016/j.xplc.2020.100135
Schindele, P., and Puchta, H. 2020. Engineering CRISPR/LbCas12a for highly efficient, temperature‐tolerant plant gene editing. Plant Biotechnology Journal 18:1118–1120. Available at: http://dx.doi.org/10.1111/pbi.13275
