CRISPR/Cas-Optimierung: Neuer Assay für Effizienz-Vergleich.
Die Genschere CRISPR/Cas ist ein etabliertes Geneditierungstool, das kontinuierlich weiterentwickelt wird, um präzisere Varianten zu schaffen, die für spezielle Anwendungen optimiert sind. Für diese Verbesserungen sind Assays erforderlich, mit denen man die Effizienz verschiedener Cas-Varianten vergleichen kann.
Ein Forscherteam der LMU München und des IPB hat kürzlich einen solchen Assay entwickelt, der einen schnellen, visuellen, quantitativen Vergleich ermöglicht. Dabei lag der Fokus auf Deletionen offener Leserahmen (ORF), also der Genabschnitte, die für Proteine codieren. Um diese Editierungs-Ereignisse sichtbar zu machen, nutzten die Forscher einen Switch-on-Mechanismus für ein Reporter-Gen, das in die Pflanzen transformiert wurde.
Dieses Reporter-Gen, entweder ein fluoreszierendes Protein oder ein Luziferase-Enzym, das ein sichtbares Signal produziert, wurde jedoch so manipuliert, dass seine mRNA eine Haarnadelschleife (HP) enthält. Diese Haarnadelschleife wird von der ebenfalls eingeführten Endoribonuklease Csy4 erkannt und gespalten, wodurch die Translation des Reporters unterdrückt wird. Mit funktionierender Csy4 ist daher kein Reportersignal detektierbar.
Csy4 wiederum diente als Ziel für eine vollständige Deletion durch das zu testende CRISPR/Cas-System. Wenn der gesamte Csy4-ORF erfolgreich deletiert wird und Csy4 demnach nicht mehr vorhanden ist, führt dies zur erfolgreichen Expression des Reporter-Gens, was eine schnelle, indirekte Quantifizierung der Geneditierungsereignisse ermöglicht.
Die Forscher aus Halle und München konnten eine mehr als 90%ige Korrelation zwischen der Reporter-Expression und vollständigen Csy4-Deletionsereignissen feststellen, was die Aussagekraft ihres Assays unterstreicht. Außerdem, so die Wissenschaftler, eigne sich das Switch-on-basierte Reporter-System besser als ein Switch-off-System, das auf der direkten Deletion des Reporter-Gens basiert und nicht zu einem sofortigem Verlust des Reportersignals führen würde.
Ausgeschaltete Reporter aufgrund von Cas-vermittelten Deletionsereignissen wären vor einem Hintergrund der noch aktiven Reportersignale nur schwer detektierbar. Hingegen stellt ein Switch-on-Assay ohne Signalhintergrund sehr sensitiv diese Ereignisse anhand der Reportersignale dar. Die Autoren der Studie weisen darauf hin, dass das Prinzip des Csy4-HP-Moduls als Cas-Target auch auf andere Reporter und Organismen übertragbar sein sollte und so das Evaluieren verschiedener Cas-Varianten erleichtert.
Originalpublikation:
Bircheneder M, Schreiber T, Tissier A, Parniske M. A quantitative assay for the efficiency of RNA-guided genome editing in plants. Plant J. 2024 Sep;119(5):2564-2577. doi: 10.1111/tpj.16931. Epub 2024 Jul 20.