UPOs geht ein Licht auf.
Unspezifische Peroxygenasen (UPOs) sind Enzyme, die selektiv und effizient Sauerstoff auf Kohlenstoffverbindungen übertragen können. UPO-katalysierte Reaktionen eignen sich daher für die Synthese verschiedenster Verbindungen, denn mit ihrer Hilfe können schwer zugängliche oder reaktionsträge Kohlenstoff- oder Heteroatome aktiviert werden. Da UPOs relativ stabil, leistungsfähig und einfach zu handhaben sind, werden sie als vielversprechende Werkzeuge für die Biokatalyse intensiv erforscht und optimiert.
Als Co-Substrat benötigen UPOs ausschließlich Wasserstoffperoxid. Jedoch erleiden die UPOs durch Wasserstoffperoxid oxidativen Stress und damit eine Beeinträchtigung ihrer Aktivität. Daher versuchen Wissenschaftler Methoden zu entwickeln, um Wasserstoffperoxid nur für die kurze Zeit der Katalyse im Reaktionsansatz bereitzustellen.
Wissenschaftler des IPB, der MLU Halle und der Universität Regensburg haben jüngst eine neue, innovative Methode zur Wasserstoffperoxiderzeugung für UPO-katalysierte Reaktionen vorgestellt. Dazu machten sie sich einen weiteren Enzymtyp, die Flavin-Mononukleotid-enthaltenden fluoreszenten Proteine (FbFP) aus Bakterien zunutze. Diese Enzyme können als Photosensitizer fungieren. Das heißt, unter Lichteinwirkung verwandeln sie mithilfe des Co-Faktors Flavin molekularen Sauerstoff aus der Luft in reaktive Sauerstoffspezies wie Wasserstoffperoxid. Die Erzeugung des Co-Substrats für die UPO kann also durch Licht an- und ausgeschaltet werden. Zwar gab es bereits ähnliche Herangehensweisen, die mit freiem Flavin als Photosensitizer im Reaktionsansatz arbeiteten, doch die Hallenser Wissenschaftler konnten mit den FbFPs deutliche Verbesserungen erzielen. Zum einen generierten sie Fusionsproteine aus einem FbFP und einer UPO und brachten so die lichtgesteuerte Erzeugung von Wasserstoffperoxid in die direkte Nähe der UPO, die es als Co-Substrat verbraucht. Anschließend wurden die durch Licht steuerbaren Fusionsproteine ausgiebig nach der zuvor etablierten Screening-Methode (siehe <link oeffentlichkeit pressemitteilungen presse-detail newsticker-wissenschaft-83-biokatalysatoren>Newsticker #83) für die Expression in Hefe optimiert. Zum anderen erlaubt die genetische Kodierung der gesamten Katalysator-Kombination flexible Anpassungen. Durch gezielte Mutationen und gerichtete Evolution sowie das Einfügen von benötigten Promotoren oder Linkern, können die Konstrukte für bestimmte Expressionsbedingungen, Substrate oder Umsetzungen optimiert werden. Eine solche Optimierung per gerichteter Evolution hatten die Forscher bereits zuvor für eine UPO gezeigt (siehe <link oeffentlichkeit pressemitteilungen presse-detail newsticker-wissenschaft-95-biokatalysatoren>Newsticker #95).
Mit den lichtgesteuerten FbFP-UPO-Fusionen gelangen den Wissenschaftler sehr effiziente Umsetzungen wie beispielsweise die Sulfoxidation von Methylphenylsulfid oder die stereoselektive Hydroxylierung von Indan zu 1-(R)-Indanol. Auch das Hochskalieren der Testreaktionen auf einen kleinen, präparativen Maßstab mit 100 mg Substrat war erfolgreich. Insgesamt konnten die Umsätze im Vergleich zur Methode mit freiem Flavin verdoppelt werden und das bei einem minimalen Reaktionsansatz aus Enzym, Substrat, Puffer als Elektronenquelle und Licht als Energiequelle für die Reduktion des Luftsauerstoffs. Ihr neues Konzept, das sie PhotUPO nennen, eröffnet neue Möglichkeiten in der Photo-Biokatalyse und könnte in Zukunft auch in Durchflusskatalysen oder in Kombination mit weiteren Katalyse-Schritten Anwendung finden, so die Autoren.
Originalpublikation:
Light-Controlled Biocatalysis by Unspecific Peroxygenases with genetically-encoded Photosensitizers. Pascal Püllmann, Dominik Homann, Tobias A. Karl, Burkhard König, Martin J. Weissenborn. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202307897. https://doi.org/10.1002/anie.202307897