Ungezielte Verfahren sind fortgeschrittene Analysetechniken, die dazu dienen, ein umfassendes Profil der kleinen Moleküle in biologischen Proben zu erstellen, ohne dass die erwarteten Metaboliten vorher bekannt sind. Diese ungerichteten Methoden zielen darauf ab, zunächst alle möglichen Signale zu erkennen und dann deren Art zu identifizieren. In der Massenspektrometrie werden bei Top-Down-Ansätzen in erster Linie sehr schnell scannende Geräte verwendet, typischerweise schnell scannende Flugzeit- (ToF) oder Quadrupol-Massenseparatoren für harte Ionisierung oder QToF MS/MS-Spektrometer für weiche Ionisierungstechniken wie Elektrospray-Ionisierung.

Bei der Tandem-Massenspektrometrie (z. B. QToF MS/MS) werden beide Molekül-Ionen und ihre Fragmentierungsmuster quasi gleichzeitig analysiert. Es gibt zwei Ansätze, wie die MS/MS-Fragmentierung ausgelöst wird:

1.      DDA - Data Dependent Acquisition (wird z. B. mit unserem timsToF durchgeführt)

2.      DIA - Data Independent Acquisition (durchgeführt mit unserem ZenoToF)

Bei DDA werden MS1-Signale, die eine Mindesthäufigkeit überschreiten, einer MS/MS-Fragmentierung unterzogen. Diese Methode hat den Vorteil, dass isotopenreine MS/MS-Spektren erzeugt werden, bei denen klar ersichtlich ist, welche Produktionen von welchem Muttermolekül-Ion abstammen. Dies hilft bei der strukturellen Interpretation von MS/MS-Spektren sehr. Der Nachteil ist jedoch, dass nur eine begrenzte Anzahl von MS/MS-Spektren innerhalb des Arbeitszyklus‘ ausgelöst werden kann und Signale mit geringer Häufigkeit werden in der Regel nicht durch wirklich ungezielte DDA-Ansätze fragmentiert.

Im Gegensatz dazu können mit DIA MS/MS-Spektren mit einer viel höheren Frequenz ausgelöst werden, praktisch mit der gleichen Rate wie MS1-Survey-Scans, aber die gewonnenen Spektren sind zunächst unrein. Gleichzeitig ist die Beziehung zwischen dem Eltern-Ion und seinen Fragmenten nicht eindeutig, da bei DIA nicht nur ein einziges Eltern-Ion für die MS/MS-Fragmentierung isoliert wird (wie bei DDA), sondern ein Massenbereich. Wenn die Übertragung von Vorläufer-Ionen den gesamten MS1-Massenbereich abdeckt, wird DDA als All-Ion-Fragmentation (AIF) klassifiziert. Es liegt auf der Hand, dass AIF bei der Erzeugung gemischter Spektren, bei denen Fragment-Ionen aus mehreren Vorläufer-Ionen gleichzeitig erzeugt werden, stark verzerrt ist. Alternativ können mehrere Geräte das Isolationsfenster ausgewählter Vorläufer-Ionen auf einen Massenbereich von wenigen Dalton eingrenzen. Wir verwenden SWATH (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra), eine von Sciex entwickelte Technologie, mit der die Erzeugung gemischter Spektren stark reduziert werden kann.

Da AIF- und SWATH-DIA-Spektren während der nachgelagerten Verarbeitung „weiter gereinigt“ werden müssen, verwenden wir chromatographische Entfaltungsalgorithmen, die wir in unserer Datenverarbeitungsplattform einsetzen.

Im Zusammenhang mit Pflanzen ermöglichen ungezielte Ansätze nicht nur eine umfassende Quantifizierung chemisch sehr unterschiedlicher kleiner Moleküle (Metaboliten) auf MS1-Ebene, sondern liefern auch strukturelle Informationen über die MS/MS-Spektren. Während DDA-Spektren isotopenreine Spektren liefern, liefern DIA-Ansätze 40-60 % mehr MS/MS-Daten, was einen umfassenderen Überblick über die Daten ermöglicht. Sowohl DDA als auch DIA sind sehr gut geeignet, um herauszufinden, welche Metaboliten oder Strukturklassen durch externe oder interne Stimuli beeinflusst werden.

Ansprechpartner: 

Dr. Gerd Balcke

Dr. Jörg Ziegler