27.02.2019

Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler des IPB entwickelten kürzlich eine neue Methode, um die gezielte Produktion wertvoller Substanzen in Pflanzen zu steuern. Dieses Verfahren der synthetischen Biologie funktioniert wie ein Schalter, der genau dann aktiviert wird, wenn zwei Bedingungen gleichzeitig erfüllt sind – ein sogenannter UND-Schalter.

Inspiriert von bereits bekannten UND-Schaltern der synthetischen Biologie, haben Tom Schreiber und Mitarbeiter jetzt einen solchen speziell für den Einsatz in Pflanzen entwickelt und in der Zeitschrift Plant Physiology vorgestellt (Schreiber et al. 2019). Dieser Schalter besteht aus zwei Protein-Komponenten, die aneinander binden können. Ist diese Bedingung, dass beide Komponenten vorliegen und interagieren, erfüllt, wird ein Signal ausgegeben. In diesem Fall wird die Expression eines gewünschten Gens in der Pflanze aktiviert. Ein solcher Schalter kann in biologischen Systemen sehr hilfreich sein, z. B. um die Expression eines spezifischen Gens unter definierten Bedingungen zu starten und zu beenden.

Schreiber et al. nutzten für ihr System sogenannte TAL-Effektorproteine (transcription activator-like effectors, TALE). Diese Effektorproteine wurden ursprünglich in pathogenen Bakterien entdeckt. Bakterien geben TALEs in die Wirtspflanze ab, wo sie innerhalb des pflanzliches Zellkerns als Transkriptionsaktivatoren wirken und für das Pathogen vorteilhafte Prozesse in Gang setzen. Neben ihrem Nutzen fürs Pathogen haben sich TALEs aufgrund ihrer besonderen Merkmale auch für Anwendungen in der synthetischen Biologie als nützlich erwiesen.

TALEs sind mit einer DNA-Bindedomäne ausgestattet und besitzen darüber hinaus eine Aktivierungsdomäne, die zur Aktivierung der Genexpression jenes Gens dient, an dessen Kontrollregion das TALE gebunden hat. In der Vergangenheit haben viele Forschergruppen DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomäne so modifiziert, dass die TALEs spezifische DNA-Sequenzen binden und dort eine gewünschte Funktion, wie z.B. Hemmung der Genexpression oder gezielte DNA-Spaltung, hervorrufen.

Um zwei Komponenten zu erhalten, teilten Schreiber und Mitarbeiter ein TALE in die Aktivierungs- und DNA-Bindungsdomäne. Folglich nannten sie ihr System „splitTALE“. Anschließend wählten sie ein Paar interagierender Proteine und fusionierten je einen Interaktionspartner an die Aktivierungs- und die DNA-Bindedomäne des TALE. Kommen diese beiden Interaktionspartner in räumliche Nähe, bilden die Aktivierungs- und DNA-Bindungsdomäne wieder eine vollständiges und funktionales TALE. Ein gewünschtes Gen, das durch TALEs gesteuert werden kann, wird dann aktiviert. Für einen derartigen, genetischen UND-Schalter müssen daher zwei interagierende Komponenten vorhanden sein, damit das gewünschte Ausgabesignal erzeugt wird.

Um die Genexpression zuverlässig auszulösen, war einiges an Optimierungsarbeit am splitTALE-System vonnöten. Die Forscher steuerten mit splitTALE zunächst ein Reportergen, das ein leicht messbares Signal erzeugt, um die Funktion zu überprüfen. Dabei fanden sie, dass die Hintergrundaktivität reduziert und das Signal des Reporters verbessert werden musste. Das erreichten Schreiber et al., indem sie die DNA-Bindungskomponente des splitTALE an einigen Stellen verkürzten und die beste Position für ein Kernlokalisierungssignal fanden. Außerdem testeten sie verschiedene Aktivierungsdomänen für eine optimale Reporteraktivität. Als Nächstes fusionierten sie verschiedene Interaktionsdomänen mit dem splitTALE, um das Auftreten von ungewollten Kreuzinteraktionen auszuschließen und die Spezifität des UND-Schalters sicherzustellen. Das so optimierte splitTALE-System wendeten sie schließlich an, um die Produktion des hochwertigen Terpens Z-Abienol in ansonsten Z-Abienol-freien Pflanzen zu steuern. Damit zeigten sie, dass es sich als potentielles Tool für Metabolic Engineering eignet.

Offensichtlich ähnelt splitTALE sehr den etablierten Protein-Protein-Interaktionstests wie z.B. der bimolekularen Fluoreszenzkomplementierung (auch als splitYFP bekannt). Es hat jedoch den Vorteil, dass es aufgrund der vernachlässigbaren Hintergrundaktivität und größeren Vielseitigkeit hinsichtlich des Reportergens, ein zuverlässigeres und besser quantifizierbares Output beim Analysieren von Protein-Protein-Interaktionen in Pflanzen bietet. Auch zukünftige Anwendungen als UND-Schalter sind denkbar. Zum Beispiel ermöglicht splitTALE ein gezieltes Anschalten von Genen in Pflanzengeweben, in denen die Expression beider splitTALE-Komponenten überlappt. Zudem besteht ein besonderer Vorteil des splitTALE-Systems in der Möglichkeit die DNA-Bindungsdomäne so anzupassen, dass auch Kontrollregionen pflanzeneigener Gene gebunden werden können. SplitTALE wurde in das modulare GoldenGate-Klonierungssystem integriert, das Forschenden ermöglicht, es auf einfache Weise für ihre jeweiligen Anwendungen zu nutzen und anzupassen.

Originalpublikation: Tom Schreiber, Anja Prange, Tina Hoppe, Alain Tissier (2019). Split-TALE: A TALE-based two-component system for synthetic biology applications in planta, Plant Physiology, pp.01218.2018; DOI: 10.1104/pp.18.01218