Mit der Golden Gate-basierten MoClo-Klonierung Multigen-Konstrukte erzeugen.
Sylvestre Marillonnet (IPB) hat zusammen mit Ramona Grützner (IPB) und Stefan Werner (Nambawan Biotech GmbH, Halle) kürzlich zwei Methodenkapitel im Band "DNA Cloning and Assembly" der bekannten Buchreihe "Methods in Molecular Biology" veröffentlicht. Die Kapitel behandeln die Golden Gate-Klonierung von Grundbausteinen (Grützner und Marillonnet, 2020) sowie deren anschließende Assemblierung zu Multigen-Konstrukten mit dem modularen Klonierungssystem MoClo (Marillonnet und Werner, 2020).
Die Verfügbarkeit effizienter DNA-Assemblierungsmethoden ist eine Grundvoraussetzung für die synthetische Biologie. Die modulare Klonierungsmethode MoClo basiert auf dem Golden-Gate-Verfahren und ermöglicht, schnell und effizient Multigen-Konstrukte aus Grundbausteinen wie Promotoren, kodierenden Sequenzen oder Terminatoren mit Hilfe von aufeinanderfolgenden Eintopfreaktionen zusammenzusetzen.
Grützner und Marillonnet stellen im ersten Kapitel zunächst ein detailliertes Protokoll für das Klonieren der Grundbausteine zur Verfügung. Sie beschreiben alle notwendigen Schritte von der Spezifizierung des zu klonierenden Bausteins, dem Primerdesign und der Fragment-Vervielfältigung bis hin zur Golden-Gate-Klonierung und Sequenzierung. Als Ergebnis der Methode stehen schließlich MoClo-Grundbausteine zur Verfügung. Diese können für weitere Assemblierungsschritte verwendet werden, um mit Hilfe des modularen Klonierungssystems MoClo Multigen-Konstrukte zu erzeugen. Im zweiten Kapitel liefern Marillonnet und Werner Standardregeln für die Assemblierungsstrategie. In einer Reihe von Eintopfreaktionen werden Bausteine und Vektoren schließlich zu den erwünschten Konstrukten zusammengefügt.
Modulare Klonierungssysteme wie MoClo haben viele Vorteile für das Engineering komplexer Stoffwechsel- oder Signalwege. Diese Systeme sind einfach in der Anwendung, effizient und ermöglichen es dem Anwender, aus vorhandenen Bibliotheken klonierter und sequenzierter Grundbausteine komplexe Multigen-Konstrukte zu erzeugen. Die Effizienz dieser Systeme ist besonders nützlich, wenn eine Vielzahl verschiedener Konstruktvarianten generiert werden soll.
Originalpublikationen:
Grützner R., Marillonnet S. (2020) Generation of MoClo Standard Parts Using Golden Gate Cloning. In: Chandran S., George K. (eds) DNA Cloning and Assembly. Methods in Molecular Biology, vol 2205. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0908-8_7
Marillonnet S., Werner S. (2020) Assembly of Multigene Constructs Using the Modular Cloning System MoClo. In: Chandran S., George K. (eds) DNA Cloning and Assembly. Methods in Molecular Biology, vol 2205. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0908-8_8