Biochemische Regulation von CDPKs
Die Bindung von Kalzium induziert eine Konformationsveränderung, wodurch das aktive Zentrum des Enzyms freigelegt und die katalytische Aktivität als Auto-Phosphorylierung und Substrat-Phosphorylierung induziert wird (Abb. 1, links). In einem Themenbereich adressieren wir die Kalziumkonzentration und Bindungskooperativität der verschiedenen Kalziumbindungen, in einem zweiten die Phosphorylierung am Enzym, und in einem dritten die Veränderungen in der Proteinfaltung und Struktur. Diese Veränderungen am Enzym bestimmen im spezifischen Zusammenspiel die Aktivität bzw. die Inaktivität einer CDPK-Isoform. So werden strikt kalziumabhängige und katalytisch hoch aktive Enzyme von niedrig konstitutiv aktiven und nahezu kalziumunabhängigen Enzymen unterschieden (Abb. 1, Mitte).
Das Ziel unserer Forschung ist es, für ausgewählte CDPKs diese biochemische Regulation in planta zu beschreiben und sie im Kontext von biologischen Stressantworten oder eines Entwicklungsgeschehens zu verstehen. Hierzu haben wir eine FRET-Methode etabliert, welche es erlaubt, basierend auf der Interaktion zwischen den CDPK-Proteindomänen, die biochemische Kalzium-induzierte Veränderung der Proteinkonformation zu verfolgen. Hierbei korreliert die Konformationsveränderung mit der Enzymaktivierung in Echtzeit. Diese Methode wenden wir an, um (1) spezifische Aminosäuren zu entschlüsseln, die die Enzymaktivität bestimmen, (2) die Integration von bereits bekannten CPDKs in ihren spezifischen Signalkaskaden zu untersuchen und (3) den biologischen Kontext und die Funktion von bisher noch wenig charakterisierten CDPKs zu identifizieren.
Angewandte Techniken:
- Proteinchemie und Enzymkatalytik
- Phosphoproteomik
- Fluoreszenz-basiertes Imaging mittels FRET
Pflanzenabwehr
Interaktionen von Pflanzen mit mikrobiellen Angreifern oder Fressfeinden führen zur Aktivierung von spezifischen pflanzlichen Abwehrantworten. Diese umfassen (1) eine lokale Initiationsphase, welche von der Erkennung des Angriffs zur Induktion intrazellulärer Signalwege führt, gefolgt von (2) der systemischen Ausbreitung von Abwehrsignalen in der gesamten Pflanze, sowie (3) der Manifestation von Abwehrantworten, in welchen die Resistenz begründet liegt (Abb. 2 ,Seybold et al., New Phytol. 2015; Hake und Romeis, Plant Cell Environ. 2018).
Wir haben nicht nur CDPKs in allen drei Teilbereichen nachgewiesen, sondern bereits in vivo Phosphorylierungssubstrate von CDPKs in der Pflanzenabwehr charakterisiert. Diese spiegeln eine multiple Funktion in der Dekodierung von Kalzium sowohl an der Plasmamembran als auch im Zellkern wider (Dubiella et al., PNAS 2013; Liu et al., Plant Cell 2017; Guerra et al., New Phytol. 2019). Insbesondere konnte eine CDPK/NADPH-Oxidase-gestützte Signalweiterleitung nach bakteriellem Angriff aufgezeigt werden. Auch konnte die zentrale Rolle von spezifischen Metabolitsignalen (chemische Mediatoren) nachgewiesen werden. Diese sind nicht nur Voraussetzung für eine systemische Aktivierung von Abwehrreaktionen, sondern auch für die Ausprägung eines pflanzlichen Immungedächtnisses.
In unserer Forschung untersuchen wir Kalzium-vermittelte molekulare, biochemische und zellbiologische Mechanismen, welche der räumlichen und zeitlichen Auflösung von Resistenz zugrunde liegen. Hierzu zählen die Aktivierung der systemisch erworbenen Resistenz, das „Sich Erinnern“ an einen früheren Angriff (sog. priming), sowie das „Vergessen“ desselben, gleichbedeutend mit dem Ausschalten des Immunsystems, wenn der feindlichen Angriff nachlässt. Die Funktion der Dekodierung von Kalziumsignalen, die molekularen Interaktionen und die Stabilität von dabei beteiligten Proteinkomponenten, sowie das Zusammenspiel mit Veränderungen in der Genexpression sowie im Muster von spezifischen Metaboliten (Phytohormonen) wird dabei konzeptionell sowohl in der Abwehr von Mikroben als auch von Fressinsekten betrachtet.
Techniken:
- Biologische Tests zu Bakterienwachstum und Herbivorie
- Molekularbiologie und Genexpressionsanalytik
- Fluoreszenz-gestütztes Kalzium Imaging
- Metabolomik
Biotechnologischer Transfer
Sowohl abiotische Veränderungen in der Umgebung von Pflanzen als auch Veränderungen in der Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit verursachen biochemische und physiologische Anpassungsmechanismen. Unsere Forschung adressieren die Funktion der Dekodierung von Kalzium mittels CDPKs, welche diesen Anpassungen zugrunde liegen (Liese et al., Biochim. Biophys. Acta 2013; Schulz et al., Plant Physiol. 2013; Kudla et al., New Phytol. 2018). Mit Bezug auf eine Verbesserung von Trockentoleranz im Zusammenspiel mit der ABA Signaltransduktion untersuchen wir in Kollaboration mit weiteren Gruppen die Funktion von CDPKs in der Regulation des Öffnens und Schließens der Schließzelle, die durch die Phosphorylierung von CDPK-Substraten wie z.B. Ionenkanälen vermittelt wird (Geiger et al., PNAS 2009, 2010, 2011). Des Weiteren untersuchen wir kalziumabhängige Enzymparameter, welche eine Differenzierung von verschiedenen CDPK-Isoformen, die dasselbe Substrat regulieren könnten, erlaubt. Die Unterschiede in der Regulierung der CDPK-Enzymaktivität bilden dabei eine Grundlage für die Entscheidung, ob ein Enzym für einen biotechnologischen Transfer geeignet ist. Zusätzlich zu den Anpassungen von Pflanzen auf Trockenstress werden biochemische und molekulare Antworten auf osmotischen Stress, Kälte sowie Nährstoffmangel untersucht. Unsere Studien beschränken sich dabei nicht nur auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana sondern wurden bereits auf Tabak (Nicotiana tabacum), Gerste (Hordeum vulgare) oder Mais (Zea mays) ausgedehnt (Weckwerth et al., Plant Cell Environ. 2014).
Unser Ziel ist es, die spezifischen biochemischen Mechanismen zu verstehen, welche das Pflanzenwachstum unter abiotischem Stress ermöglichen, die beteiligten Proteinkomponenten zu charakterisieren und deren entsprechende molekulare und strukturelle Grundlagen zu entschlüsseln. Entscheidungsgrundlage für einen Transfer in Nutzpflanzen, wie beispielsweise Getreide oder Kartoffel, bilden anschließend das Zusammenspiel aus Funktion, biochemischer Eigenschaft und Regulation identifizierter Signalkomponenten. Die resultierenden Nutzpflanzen sollen dann unter verschiedenen Stresssituationen in Hinblick auf ein verändertes Wachstum, Ertrag und Stresstoleranz getestet werden (Abb. 3).
Techniken:
- Biologische Wachstums-, Ertrags-, und Toleranztests
- Physiologische Studien
