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Calcium-Signale in der MAMP-vermittelten Signaltransduktion

Der schnelle Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration innerhalb weniger Minuten nach MAMP-Erkennung ist eine notwendige Voraussetzung für die meisten nachfolgenden Abwehr-relevanten Signale. Zur Identifizierung neuer Abwehr-Komponenten haben wir das Apoaequorin-basierte [Ca2+]-Messsystem für Hochdurchsatz-Messungen im Mikroplatten-Format für genetische Screens optimiert (Abb. 2). Dieser Ansatz führte zur Identifizierung von Mutanten mit einem veränderten cytoplasmatischen [Ca2+]-Anstieg (cce, “changed calcium elevation“) nach MAMP-Erkennung, z.B. des bakteriellen Flagellin-Peptides flg22. Darunter sind neue Mutanten-Allele von Rezeptorkomplex-Komponenten (z.B. FLS2 Rezeptor, BAK1 Co-Rezeptor, PBL1/BIK1 Rezeptor-ähnliche cytoplasmatische Kinasen; Ranf et al., 2011, 2012, 2014) und des Rezeptor-Qualitätskontrollweges (kontrolliert die korrekte Protein-/Rezeptor-Glycosylierung; Trempel et al., 2016). Die große Anzahl an Rezeptor-Mutanten unter den MAMP-spezifischen cce-Mutanten zeigt, dass dieser Screen hervorragend zur Isolierung von Rezeptorkomplex-Komponenten geeignet ist. So gelang uns die Identifikation der Rezeptor-ähnlichen Kinase LORE (“LipoOligosaccharide-specific Reduced Elicitation“) als ersten möglichen Lipopolysaccharid-Rezeptor (Ranf et al., 2015). Mit diesem Ansatz hoffen wir, neue Rezeptoren und Signal-Komponenten zu identifizieren und deren Rollen innerhalb der pflanzlichen Abwehrsignalgebung aufzuklären.

Abb. 2. Schnelle Änderungen der cytosolischen Ca2+-Konzentrationen innerhalb von Minuten nach Behandlung mit flg22 (F) oder Wasser (W) können durch Lumineszenz in Arabidopsis Pflanzen visualisiert werden, die den Ca2+-Reporter Apoaequorin exprimieren. Dieser Ansatz bietet sich für Hochdurchsatz-Messungen im Mikroplatten-Format für genetische Screens an.
Abb. 2. Schnelle Änderungen der cytosolischen Ca2+-Konzentrationen innerhalb von Minuten nach Behandlung mit flg22 (F) oder Wasser (W) können durch Lumineszenz in Arabidopsis Pflanzen visualisiert werden, die den Ca2+-Reporter Apoaequorin exprimieren. Dieser Ansatz bietet sich für Hochdurchsatz-Messungen im Mikroplatten-Format für genetische Screens an.

Kontrolle der pflanzlichen Abwehr durch Mitogen-aktivierte Protein-Kinasen (MAPKs)

Genetisch modifizierte Pflanzen, die induzierbare MAPK-Aktivität besitzen, zeigen ein verändertes Phospho-Proteom und eine Hyper-Akkumulation von Abwehr-Metaboliten (Lassowskat et al., 2014; Lee et al., 2015). Dies zeigt, dass MAPKs eine Schlüsselrolle in der Abwehr zukommt. Interessanterweise regulieren oftmals die gleichen MAPKs mehrere Wachstums- und Entwicklungs-relevante Signalwege. Die Regulation der Aufrechterhaltung der Signalqualität ohne fälschliche Vernetzung mehrerer Signalwege in Pflanzen ist noch nicht gut erforscht. Wahrscheinlich sind unterschiedliche Expressionsmuster der MAPKs, ihre Substrat-Diversität, sowie Signalweg-spezifische Proteinkomplexe von Bedeutung. Verschiedene Strategien werden verfolgt, um MAPK-Substratproteine und -Interaktoren zu isolieren u.a. Hefe-Dihybrid-Screens, Phospho-Proteomik und Protein-Array-basierte Screens (Abb. 3). In unseren Projekten versuchen wir, Abwehr-relevante MAPK-Substrate zu identifizieren und den Einfluss der Phosphorylierung auf ihre Funktion aufzuklären. Da aktivierte MAPKs oft in den Zellkern re-lokalisieren (Abb. 4), um transkriptionelle Prozesse zu regulieren, setzen wir unseren Fokus auf Transkriptionsfaktoren und assoziierte Proteine (Bethke et al., 2009; Pecher et al., 2014). Des Weiteren untersuchen wir die MAPK-vermittelte Regulation posttranskriptioneller Prozesse in der Pathogenabwehr (Maldonado-Bonilla et al., 2014).

Abb. 3. Arabidopsis Protein-Array zum in vitro-Screening von MAPK-Substraten (photographische Überlagerung mit Arabidopsis-Pflanzen).
Abb. 3. Arabidopsis Protein-Array zum in vitro-Screening von MAPK-Substraten (photographische Überlagerung mit Arabidopsis-Pflanzen).
Abb. 4. Immuno-Lokalisierung von MAPKs nach MAMP-Behandlung. MAPKs lokalisieren im Zellkern (oben) und die innerhalb der Signalkaskade übergeordneten MAPK-Kinasen (MAPKKs) im Zytoplasma (unten). Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt (rechts, in blau).
Abb. 4. Immuno-Lokalisierung von MAPKs nach MAMP-Behandlung. MAPKs lokalisieren im Zellkern (oben) und die innerhalb der Signalkaskade übergeordneten MAPK-Kinasen (MAPKKs) im Zytoplasma (unten). Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt (rechts, in blau).

Die Unterdrückung der Abwehr durch Effektorproteine

Pathogene setzen Effektorproteine ein, um mit der pflanzlichen zellulären Abwehr-Signalgebung zu interferieren. Kürzlich veröffentlichten wir ein Studie, in der wir zeigen, dass das Effektorprotein AvrRpt2 aus Pseudomonas syringae, sowie zahlreiche, vorhergesagte Homologe aus Bakterien, spezifisch die flg22-induzierte Aktivierung der MAPKs MPK4/MPK11, aber nicht von MPK3/MPK6 blockieren (Eschen-Lippold et al., 2016). Diese Selektivität der Interferenz mit MAPK-Signalwegen repräsentiert wahrscheinlich eine neuartige Strategie von Pathogenen, die MAPK-regulierte zelluläre Signalgebung zu modifizieren. Dieses Phänomen ist interessanterweise unabhängig von RIN4 (einem wichtigen Regulator der pflanzlichen Abwehr und AvrRpt2-Substrat), benötigt aber die Cystein-Protease-Aktivität von AvrRpt2. Unser Ziel ist die Identifizierung zusätzlicher AvrRpt2-Substrate, die sich verantwortlich für den inhibitorischen Effekt auf die MPK4/MPK11-Aktivierung zeigen, um deren Einfluss auf die Abwehr-Signalwege und letztendlich auf die Resistenz aufzuklären.

Diese Seite wurde zuletzt am 08.02.2017 geändert.

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