zur Suche springenzur Navigation springenzum Inhalt springen

Metabolite Profiling von Arabidopsis thaliana unter Einfluss verschiedener Stressoren

Pflanzen können über 100.000 Substanzen produzieren, die man Sekundärmetabolite nennt. Diese zumeist kleinen Moleküle sind für den Grundstoffwechsel nicht unbedingt nötig. Ihre Entstehung und Diversität verdanken sie evolutionären Anpassungsprozessen der Pflanze an biotischen und abiotischen Stress. Viele wissenschaftliche Fragestellungen befassen sich mit den molekularen Grundlagen der Stressabwehr. Zur Erfassung der großen Vielfalt an Sekundärmetaboliten bedient man sich zunächst der ungerichteten Analyse, um für die Fragestellung relevante Substanzen (z.B. stressinduzierte, nur in bestimmten Genotypen vorhandene) herauszufinden. Die Modellpflanze Arabidopsis bietet viele Vorteile für molekulare Analysen: ihre geringe Größe, eine schnelle Entwicklung, ein kleines, vollständig sequenziertes Genom und eine umfassende Sammlung von mutierten Allelen. Obwohl Arabidopsis wirtschaftlich nicht genutzt wird, sind die meisten Sekundärstoffwechselwege vorhanden und können in Stressexperimenten aktiviert werden.

Wir kultivieren Arabidopsis in verschiedenen experimentellen Systemen (Sterilkultur, Klimakammer) um die Bildung von Sekundärmetaboliten anzuregen. Standardisierte Probenahme und –vorbereitung, Standardmethoden für LC-Trennung und ESI-ToF-MSnt und laborinterne Qualitätskontrolle ermöglichen zuverlässige Messungen und die Anwendung effizienter Auswertemethoden.

Unser softwaregestütztes Metabolite Profiling umfasst die Extraktion der Masse-Retentionszeitenpaare, das Alignment zwischen den Proben, Normalisierung auf internen Standard, Gruppierung von Addukten und das relative Quantifizieren. Die so vorbereiteten Daten werden dann statistisch in PCAs, Mittelwertvergleichen und Korrelationen verrechnet. So gefundene relevante Substanzen können dann weiter identifiziert und quantifiziert werden.

Zur einfachen Annotierung der Massenlisten erweitern wir kontinuierlich unseren hausinternen Arabidopsis-Metabolitenatlas, der aktuell mehrere hundert Sekundärmetabolite (Phenylpropanoide, Glucosinolate, Phytoalexine, Indole) und anderen Substanzklassen (Fett-, Aminosäurederivate u.a.) enthält. Zurzeit wird dieser außerdem noch durch MS/MS-Spektren erweitert.

Abb. 1. Links: Kultursysteme dienen der standardisierten Pflanzenanzucht und der gezielten Applikation von Stress. Rechts: Mit Hilfe von uni- und multivariater Statistik werden Unterschiede (z.B. Mutante vs. Wildtyp) und Effekte (z.B. Stress vs. Kontrolle) untersucht. MS-MS-Spektren werden zur Identifizierung von Metaboliten herangezogen.
Abb. 1. Links: Kultursysteme dienen der standardisierten Pflanzenanzucht und der gezielten Applikation von Stress. Rechts: Mit Hilfe von uni- und multivariater Statistik werden Unterschiede (z.B. Mutante vs. Wildtyp) und Effekte (z.B. Stress vs. Kontrolle) untersucht. MS-MS-Spektren werden zur Identifizierung von Metaboliten herangezogen.


Abb. 2. 13C -Markierung von Arabidopsis thaliana- Metaboliten während der Photosynthese und 13C Verteilung in der Pflanze durch Metabolismus und Stofftransport bis zur Exsudation. Massenspektrometrie dient zur Quantifizierung der eingebauten 13C-Isotopen in Blatt-, Wurzel- und Exsudat-Metaboliten.
Abb. 2. 13C -Markierung von Arabidopsis thaliana- Metaboliten während der Photosynthese und 13C Verteilung in der Pflanze durch Metabolismus und Stofftransport bis zur Exsudation. Massenspektrometrie dient zur Quantifizierung der eingebauten 13C-Isotopen in Blatt-, Wurzel- und Exsudat-Metaboliten.

13C-Isotopen-Markierung von Arabidopsis thaliana: Der Metabolismus von Photosynthese bis zur Exsudation

Pflanzen reagieren nicht nur auf veränderte Umweltbedingungen, sondern wirken aktiv auf ihren Standort ein. Ihre Wurzeln sekretieren organische Verbindungen, sogenannte Exsudate, die Bodenbeschaffenheit und das Bodenmikrobiom verändern. Bislang ist nur wenig über die Bildung dieser Exsudate bekannt: Wie sind die Zusammenhänge zwischen Kohlenstoff-Fixierung in der Photosynthese, Metabolit-Transport, Metabolit-Umsatz in den Geweben und Exsudation? Wie lang dauert dieser Prozess? Durch 13CO2 während der Pflanzenanzucht können Metaboliten von der Photosynthese ausgehend markiert und detektiert werden: Sie erscheinen in der Massenspektrometrie schwerer. Metabolite mit hohem Umsatz werden schneller markiert als solche mit langsamen Umsatz-Raten. Zeitreihen- und Kompartiment-Analysen geben Aufschluss über Gewebe-spezifische Metaboliten-Muster, metabolische Umsätze, Transport zwischen den Geweben sowie Exsudationsmuster und -Dynamik.


Beziehung von Biodiversität und Exsudaten sowie Wurzelmetaboliten in Graslandgesellschaften

Abb. 3. Interaktion von Wildkräutern und Wildgräsern mit anderen Pflanzen und Mikroorganismen in der Rhizosphäre.  Die Identifizierung der molekularen Kommunikationsmöglichkeiten erfolgt via der Analyse der wurzelspezifischen Exsudate mittels Massenspektrometrie.
Abb. 3. Interaktion von Wildkräutern und Wildgräsern mit anderen Pflanzen und Mikroorganismen in der Rhizosphäre. Die Identifizierung der molekularen Kommunikationsmöglichkeiten erfolgt via der Analyse der wurzelspezifischen Exsudate mittels Massenspektrometrie.

Während der Forschungsbereich der Pflanzenmetabolite unter Laborbedingungen bereits breit gefächert erforscht wird, ist wenig bekannt über das Verhalten von Pflanzen in der Rhizosphäre unter natürlichen Bedingungen und welchen Beitrag exsudierte Metabolite zur Biodiversität der Lebensgemeinschaft beisteuern. Dieses DFG geförderte, kooperative Projekt zwischen Ökologie und Metabolomics versucht diese Lücke durch ungerichtetes Metabolite Profiling der Grasland Lebensformen, Gräser und Kräuter, zu schließen. Zehn verschiedene Spezies dieser Lebensformen wurden in den Deutschen Biodiversitäts Exploratorien (DFG Schwerpunktprogramm) unter Feldbedingungen sowie unter kontrollierten Bedingungen in einer Phytokammer angezogen. Durch Nutzung eines Mörserroboters und beider massenspektrometrischen Methoden, Flüssigkeits- und Gaschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie, wurden sowohl Exsudat- als auch Wurzelproben beider experimentellen Aufbaus auf ihre primären und sekundären Metabolitprofile analysiert. Die Identifikation der Metabolite erfolgt mit Hilfe von Datenbanken und erweiterten massenspektrometrischen Methoden wie MSn, GC-APCI-TOF-MS und H/D Austausch. Dabei tragen verschiedene bioinformatische und statistische Analysen aller Datensets zur Klärung der Frage bei ob
(i) das Exsudationsprofil von Pflanzen durch die Familie oder
(ii) die Spezies bestimmt wird. In Kooperation mit Ökologen und Mikrobiologen sowie der Verknüpfung der Daten aus den Feld- und Laborexperimenten kann
(iii) die funktionelle Rolle von exsudierten Metaboliten in der Biodiversität der Rhizosphäre bestimmt werden und geklärt werden
(iv) ob Beobachtungen aus dem Labor unter natürlichen Bedingungen bestätigt werden können. Durch den Vergleich von Wurzel- und Exsudatdaten kann außerdem
(v) die Möglichkeit der Wiederspiegelung des exsudierten Metabolitprofils durch den Wurzelmetabolismus getestet werden.

Diese Seite wurde zuletzt am 06.03.2017 geändert.

IPB Mainnav Search