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Entwicklung neuer Werkzeuge für die pflanzliche Gentechnik

Mittlerweile ist unsere grundlegende Strategie zur Erzeugung von Multigenkonstrukten gut etabliert und voll funktionsfähig. Derzeit erweitern wir das MoClo-System durch neue Komponenten wie neuartige Vektoren und zusätzliche DNA-Elemente. Beispielsweise wird im Rahmen eines unserer Projekte eine Promotoren-Bibliothek entwickelt, die die Ko-Expression mehrerer Gene in demselben Zelltyp einer Pflanze ermöglicht. Mit diesem System wurden (in Kooperation mit der AG Tissier) synthetische Promotoren hergestellt, die eine Bindestelle für einen synthetischen Designer-TAL-Effektor (eine 19 bp Sequenz) mit beliebigen angrenzenden Sequenzen besitzen. Diese synthetischen Designer-TAL-aktivierten Promotoren (STAPs) werden nur aktiviert, wenn der entsprechende TAL-Effektor daran bindet. Es wird dann ein Multigenkonstrukt aus Genen, die unter der Kontrolle dieser synthetischer Promotoren ko-exprimiert werden sollen, und dem entsprechenden TAL-Effektor erzeugt, wobei letzterer unter Kontrolle eines gewebespezifischen pflanzlichen Promotors steht (Abb. 2). Mithilfe dieser Strategie werden alle Gene unter Kontrolle eines STAPs in demselben Zelltyp ko-exprimiert, in dem auch der TAL-Effektor exprimiert wird, wie zum Beispiel in Blütenblättern oder im Pollen (Abb. 2).

Abb. 2. Gewebespezifische Expression eines synthetischen Betanin-Biosyntheseweges in Nicotiana benthamiana. (A) Wildtyp und transgene Nicotiana benthamiana Blüten. Letztere exprimieren drei Gene zur Betanin-Biosynthese in vielen Geweben (1), in Blüten (2) oder im Pollen (3). (B) Struktur der Konstrukte, die zur Erzeugung der transgenen Pflanzen in (A) verwendet wurden.  Der TAL-Effektor-basierte Transkriptionsfaktor bindet an Sequenzen in drei synthetischen TAL-aktivierten Promotoren (p). Dies führt zur Transkription der drei Gene des Syntheseweges in Zellen, in denen der gewebespezifische Promotor aktiv ist.
Abb. 2. Gewebespezifische Expression eines synthetischen Betanin-Biosyntheseweges in Nicotiana benthamiana. (A) Wildtyp und transgene Nicotiana benthamiana Blüten. Letztere exprimieren drei Gene zur Betanin-Biosynthese in vielen Geweben (1), in Blüten (2) oder im Pollen (3). (B) Struktur der Konstrukte, die zur Erzeugung der transgenen Pflanzen in (A) verwendet wurden. Der TAL-Effektor-basierte Transkriptionsfaktor bindet an Sequenzen in drei synthetischen TAL-aktivierten Promotoren (p). Dies führt zur Transkription der drei Gene des Syntheseweges in Zellen, in denen der gewebespezifische Promotor aktiv ist.

Entwicklung von Vektoren und Elementen für die Hefeexpression

Gentechnische Veränderungen an Hefe können durch das Einschleusen genetischen Materials entweder in eines der Hefechromosomen oder in extrachromosomal replizierende Episomen vorgenommen werden. Wir entwickeln Vektoren und Elemente zur gentechnischen Modifizierung von Hefe mittels beider Wege.

Ein bedeutender Vorteil des MoClo-Systems ist die Möglichkeit zur Herstellung ganzer Bibliotheken von Konstrukten statt nur einzelner Konstrukte. Beispielsweise wurde eine Konstruktbibliothek zur β-Carotin-Biosynthese erstellt, wobei die Promotoren und die Terminatoren eines jeden Konstrukts aus einer Bibliothek von zehn Promotoren und zehn Terminatoren zufällig kombiniert wurden (Abb. 3). Daher ist davon auszugehen, dass aus dieser Bibliothek sehr viele unterschiedliche, nicht identische Konstrukte hervorgehen. Die beste Promotor/Terminator-Kombination kann in diesem Fall anhand der orangen Farbe des β-Carotins visuell ermittelt werden. Des Weiteren arbeiten wir an Vektoren und Elementen zur Integration von Konstrukten ins Hefegenom mittels CRISPR/Cas9.

Abb. 3. Herstellung einer Bibliothek von Carotinoid-produzierenden Hefezellen. (A) Eine Konstrukt-Bibliothek wurde mittels kombinatorischer Assemblierung in einem Reaktionsansatz aus zehn Promotoren und zehn Terminatoren und drei β-Carotin-Biosynthesegenen generiert. Diese in E. coli-Zellen hergestellte Bibliothek wird dann in Hefezellen transformiert. (B) Hefezellen, die die Carotinoid-Konstrukt-Bibliothek exprimieren.
Abb. 3. Herstellung einer Bibliothek von Carotinoid-produzierenden Hefezellen. (A) Eine Konstrukt-Bibliothek wurde mittels kombinatorischer Assemblierung in einem Reaktionsansatz aus zehn Promotoren und zehn Terminatoren und drei β-Carotin-Biosynthesegenen generiert. Diese in E. coli-Zellen hergestellte Bibliothek wird dann in Hefezellen transformiert. (B) Hefezellen, die die Carotinoid-Konstrukt-Bibliothek exprimieren.

Engineering pflanzlicher Biosynthesewege

Abb. 4. Frucht von Bixa orellana mit Samen. Die Samen sind mit einer roten Substanz überzogen, die das Apocarotinoid Bixin enthält. Foto: M.H. Walter.
Abb. 4. Frucht von Bixa orellana mit Samen. Die Samen sind mit einer roten Substanz überzogen, die das Apocarotinoid Bixin enthält. Foto: M.H. Walter.

Das Interesse unserer Forschungsgruppe richtet sich auf pflanzliche Biosynthesewege, die farbige Stoffwechselprodukte wie Betalaine, Anthocyane und Carotinoide hervorbringen. Diese Synthesewege eignen sich einerseits modellhaft zur Toolbox-Entwicklung und können andererseits in heterologen mikrobiellen oder pflanzlichen Systemen zur Produktion genutzt werden. Außerdem arbeiten wir daran, in noch unvollständig aufgeklärten Biosynthesewegen die unbekannten Gene/Enzyme zu identifizieren. Ein Carotinoid-Derivat von Interesse ist Bixin, das industriell als natürlicher Lebensmittelfarbstoff eingesetzt wird. Bixin akkumuliert in den Samen des Baumes Bixa orellana (Abb. 4) und wird vermutlich durch enzymatische Spaltung und Modifizierung einer Carotinoid-Vorstufe erzeugt. Wir erforschen die noch unbekannten Gene, die für Enzyme in der Bixin-Synthese kodieren, um schließlich den gesamten Biosyntheseweg gentechnisch in heterologen Wirtsorganismen rekonstituieren zu können.

Diese Seite wurde zuletzt am 17.02.2017 geändert.

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