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Aromatische Oligoprenyltransferasen am Beispiel der ubiA-Transferase aus E. coli

Das Projekt beschäftigte sich mit chemische Sonden und Substraten zur Untersuchung von aromatischen Prenyltransferasen und deren Produkten. Enzymkatalysierte Reaktionen bieten außer den naheliegenden Vorteilen ihrer Chemo-, Regio- und Stereoselektivität vor allem Möglichkeiten, Reaktionen unter besonders milden Bedingungen (z. B. in Wasser) und auch im Mikromaßstab reproduzierbar durchzuführen.Von besonderem Interesse sind dabei Enzyme, die C-C-Verknüpfungsreaktionen katalysieren. Gegenstand dieses Projektes sind aromatische Prenyltransferasen: Zwei-Substrat-Enzyme, die Aromaten mit Prenylketten verknüpfen. Die p-Hydroxybenzoat-Oligoprenyltransferase („ubiA-Transferase“) aus E. coli katalysiert die Prenylierung der meta-Stellung von 4-Hydroxybenzoesäure unter Abspaltung einer Diphosphateinheit. Prenylierte Aromaten haben eine zentrale Bedeutung im Elektronentransfer (Ubichinone, Vitamin E) und sind Grundlage elementar wichtiger Lebensprozesse, viele sind aber auch Wirkstoffe und Sekundärmetaboliten in Pflanzen, Pilzen und Bakterien.

Abb.1. Oligoprenylierung von 4-Hydroxybenzoat (PHB, 1), wie sie z. B. durch die ubiA-Prenyltransferase katalysiert wird (n ³ 2)).
Abb.1. Oligoprenylierung von 4-Hydroxybenzoat (PHB, 1), wie sie z. B. durch die ubiA-Prenyltransferase katalysiert wird (n ³ 2)).

In unserem Arbeitskreis wurde bereits ein Modell für das aromatische Substrat entwickelt, eine Zweites für das Prenyldiphosphatsubstrat soll folgen. Dies erfordert die Synthese und enzymatische Evaluierung von über 15 verschiedenen Diphosphat-Substraten, bislang schwierig darstellbaren Verbindungen.  Schließlich können die geeignetsten Komponenten dieser Bisubstrat-Reaktion für kombiniert biokatalytisch-chemische Totalsynthesen natürlicher prenylierter Aromaten herangezogen werden.  Weiter wurden die Diphosphat-Imitate 5-10 als Inhibitoren dieser bakteriellen Enzyme und auch potentielle Liganden fur die Affinitätschromatographie zur Isolierung und Reinigung von Prenyltransferasen synthetisiert.

Abb. 4. Diphosphat-Imitate als Prenyltransferase-Inhibitoren.
Abb. 4. Diphosphat-Imitate als Prenyltransferase-Inhibitoren.

Um die Bindung nicht-spaltbarer Diphosphat-Imitate an die ubiA-Transferasezu untersuchen wurden diese Verbindungen als 0.5 - 10 mM Lösungen der Umsetzung von Geranyldiphosphat zugfügt. Z. B. wirken die Ketocarbonsäure 6 und die Hydroxycarbonsäure 9 als schwache kompetitive Inhibitoren.

Abb. 5. Inhibierung von GBA-Synthese.
Abb. 5. Inhibierung von GBA-Synthese.
Abb. 6. GBA-Synthese als Funktion von EDTA Konzentration.
Abb. 6. GBA-Synthese als Funktion von EDTA Konzentration.

Bei niedriger Konzentrationen haben die Substanzen einen höchst ungewöhnlichen Aktivierungeffekt gezeigt (Abb. 5). Es wurde vermutet, dass die Magnesiumionen-Komplexierung dafür verantwortlich ist. Magnesium(II) spielt in der Reaktion eine doppelte Rolle. Einerseits ist es zur Enzymaktivierung notwendig, andererseits hat die Mg(2+)-Konzentration eine negative Wirkung auf Enzymstabilität. Diese Hypothese wurde nach Experimenten mit EDTA bestätigt. 

Wichtige Werkzeuge für funktionale Untersuchungen stellen Substrate dar, die in biochemisch unverfänglicher Position eine Funktionsgruppe tragen. Dies können Isotopenmarkierungen aber auch insbesondere Farbstoffe, wie Fluoreszenzfarbstoffe, zur Lokalisation sein.

Diese Seite wurde zuletzt am 11.02.2013 geändert.

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