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Revers-genetische Charakterisierung der Arabidopsis IQD Genfamilie

IQD Genfamilien sind spezifisch für Landpflanzen und kodieren etwa 30 Proteine für die bisher annotierten Familien in Arabidopsis, Reis und Tomate. Das charakteristische Merkmal der IQD Proteine ist ihre zentrale Region von 67 konservierten Aminosäureresten, die als IQ67-Domäne bezeichnet wird.  Diese Region besteht aus jeweils mehreren, teilweise überlappenden Kopien (1-4x) von calcium-unabhängigen (IQ-Motiv) als auch calcium-abhängigen (1-5-10 und 1-8-14) Calmodulin(CaM)-Interaktionsmotiven mit definiertem Abstand zueinander. Ein weiteres Charakteristikum der IQD Genfamilien in Arabidopsis und Reis ist die symmetrische Struktur ihrer annotierten Exons, die fast ausschließlich von Introns der Phase-0 flankiert werden. Die Zahl der Exons variiert (2-6) und damit auch die Länge der kodierten IQD Proteine (~100-900 Aminosäurereste). Beide Eigenschaften lassen vermuten, dass Exon-Shuffling eine wichtige Rolle während der Evolution von IQD Proteinen spielte, die eine Vielfalt an Domänen hervorbrachte, welche die zentrale IQ67 Domäne umgeben. Des weiteren führten genomweite Duplikationen zum heutigen Umfang der IQD Familien in Arabidopsis und Reis, die sich durch einen verhältnismässig hohen Anteil an paralogen Genpaaren (~45%) auszeichnen. Eine Erklärung dafür ist die Aufrechterhaltung stoichiometrischer Verhältnisse in regulatorischen Multiproteinkomplexen, an deren Bildung IQD Proteine beteiligt sein könnten. Obwohl IQD Proteine mit berechneten molekularen Massen von 12-90 kDa strukturell sehr unterschiedlich sind, zeichnen sie sich auch durch eine Reihe gemeinsamer physiko-chemischer Eigenschaften aus, wie z.B. basischer isoelektrischer Punkt (pI~10.3) oder einen hohen Anteil an Arg/Lys (~17%) und Ser (~12%) Resten, die für RNA-bindende Proteine charakteristisch sind. Interessanterweise sind die sehr wenigen atypischen IQD Gene und kodierten Proteine mit abweichenden Eigenschaften zumindest in Arabidopsis als auch Reis anzutreffen, was auf hochkonservierte Funktionen von IQD Proteinen schließen lässt.

Eine Aufklärung der biochemischen Funktionen von IQD Proteinen und relevanten biologischen Prozessen ist für ein umfassendes Verständnis der calcium-abhängigen Signalwandlung in Pflanzen sehr hilfreich und wichtig. Zu diesem Zweck generieren wir eine umfangreiche Sammlung revers-genetischer Ressourcen zum Studium der Arabidopsis IQD Genfamilie. Für die meisten der 33 IQD Gene haben wir bereits Insertionsmutanten und Überexpressionslinien erstellt, deren Analyse auf vielfältige Funktionen von IQD-Proteinen während der pflanzlichen Entwicklung und Anpassung an veränderte Umweltbedingungen schließen lassen. Die phänotypische Charakterisierung dieser Linien wird durch systematisches Kreuzen zur Erzeugung multipler iqd-Kockout-Linien komplementiert. Des weiteren generieren wir transgene Arabidopsis-Pflanzen mit verschiedenen Reportergenkonstrukten (IQD Promoter-GUS/GFP-Linien), um die gewebe- und zellspezifische Expression aller IQD-Gene als auch die subzelluläre Lokalisierung der kodierten Proteine zu katalogisieren.

Funktionelle Analyse von Arabidopsis IQD1 und ausgewählten IQD-Proteinen

IQD1(IQ67-DOMAIN 1), das bisher am besten charakterisierte Mitglied der 33-köpfigen IQD Familie putativer Zielproteine von CaM und CaM-ähnlichen (CML) Calciumsensoren in Arabidopsis, wurde in einem genetischen Screen nach Mutanten mit veränderter Glukosinolatproduktion identifiziert. Das gewebespezifische Expressionsmuster von IQD1 ähnelt dem zahlreicher Gene mit Funktionen in der Glukosinolatbiosynthese, und IQD1-Überexpression stimuliert Glukosinolatakkumulation sowie Resistenz gegen Herbivorie. Das kodierte Protein bindet über seine IQ67-Domäne in vitro und in vivo an verschiedene CaM/CML Proteine. Ein genetischer Screen in Hefe nach weiteren IQD1-Interaktoren identifizierte KLCR1 (kinesin light chain-related protein 1) und GSTU26, eine Glutathion-S-transferase mit möglicher Funktion in der Glukosinolatsynthese. IQD1 ist im Zellkern, einschließlich im Nukleolus, lokalisiert und ist darüber hinaus am Zytoskelett (Mikrotubuli) assoziiert. Kotransfektionsstudien in Tabakblättern zeigten, dass IQD1 verschiedene CaM/CML Proteine als auch KLCR1 an die Mikrotubuli rekrutiert, was auf eine regulatorische Funktion von IQD1 als sogenanntes Scaffold-Protein für die Beladung von Kinesin-Motorproteinen mit nachfolgendem Transport von Multiproteinkomplexen schließen läßt. Des weitern bindet IQD1 in vitro einsträngige Nukleinsäuren, so dass diese Hypothese auf den zellulären Transport von RNA-Protein-Komplexen als zusätzlichen Mechanismus für eine Feinabstimmung der Genexpression erweitert werden kann.

Ziele unserer Forschungsarbeiten, die als ein Teilprojekt (B12) des SFB 648 „Molekulare Mechanismen der Informationsverarbeitung in Pflanzen“ bearbeitet werden, sind:
(i) detaillierte Struktur-Funktions-Analysen zur Identifizierung struktureller Komponenten, die für die Phosphorylierung von IQD1, sowie für die Interaktion von IQD1 mit CaMs/CMLs, GSTU26, KLCRs und Nukleinsäuren verantwortlich sind,
(ii) Identifizierung und Charakterisierung von zusätzlichen mit IQD1 interagierenden Proteinen und potentiellen RNAs, und
(iii) Untersuchungen zur physiologischen Funktion von IQD1 in der Regulation von Abwehrsignalwegen.
Übergreifendes Ziel dieser Untersuchungen ist eine Aufklärung der Verknüpfung von Calcium Signaling mit IQD1-regulierten biologischen Prozessen wie z.B. dem Abwehrstoffwechsel.

Weitere geplante Arbeiten konzentrieren sich auf Struktur-Funktions-Analysen und biophysikalische Studien mit IQD20, dem kleinsten IQD Protein, das zusätzlich zur IQ67 Domäne nur noch über einen kurzen (35 aa) N-terminus verfügt. Ähnliche biochemische Untersuchungen wie für IQD1 und IQD20 geschildert, werden sich auf ausgewählte Mitglieder der Arabidopsis IQD-Familie erstrecken, sobald interessante potenzielle biologische Funktionen aus dem revers genetischen Ansatz ersichtlich werden.

Diese Seite wurde zuletzt am 09.02.2017 geändert.

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