IQD-Genfamilien sind spezifisch für Landpflanzen und kodieren etwa 30 Proteine in Arabidopsis, Reis, Tomate, Pappel und anderen Angiospermen (Zusammenfassung in Kölling et al., 2019). Das charakteristische Merkmal der IQD-Proteine ist ihre zentrale Region von 67 konservierten Aminosäureresten, die als IQ67-Domäne bezeichnet wird und die Interaktion mit CaM-Kalziumsensoren vermittelt (Bürstenbinder et al., 2013). Außerhalb der IQ67-Domäne besitzen IQDs große Bereiche vorhergesagter intrinsischer Unordnung, was auf mögliche Funktionen als Gerüstproteine in der Assemblierung makromolekularer Komplexe hindeutet. Eine umfangreiche Analyse der gesamten Arabidopsis-IQD-Familie ergab, dass IQDs an Mikrotubuli, an der Plasmamembran und im Zellkern vorkommen (Bürstenbinder et al., 2017). Mit Interaktionsstudien im Hefe-Zwei-Hybrid-System konnten Proteine der Kinesin-Light-Chain-Related (KLCR)-Familie als Interaktionspartner von IQD1 und verwandten Proteinen identifiziert werden (Bürstenbinder et al., 2013). Zellbiologische Untersuchungen in Nicotiana benthamiana zeigten, dass IQDs die Rekrutierung von KLCRs und CaM/CMLs ans Mikrotubuli-Zytoskelett vermitteln. Wir vermuten daher, dass IQDs als Gerüstproteine für die Assemblierung von CaM-Signalmodulen dienen, um Kalziumsignale während der Wachstumsregulation an Mikrotubuli zu integrieren.
Projekt 1: Funktionen von IQD Proteinen in der Regulation von Wachstum und Entwicklung
Um biologische Funktionen von IQD-Proteinen und interagierenden KLCRs systematisch zu entschlüsseln, generieren wir eine umfangreiche Sammlung revers-genetischer Ressourcen zum Studium der Arabidopsis-Genfamilien. Phänotypische Untersuchungen von IQD-Überexpressionslinien deuten auf vielfältige Funktionen von IQD-Proteinen in der Organisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts während der pflanzlichen Entwicklung hin (Bürstenbinder et al., 2017). Histochemische GUS-Analysen in PromotorIQD:GFP-GUS-Reporterlinien zeigten präferentielle Expression von IQDs in sich aktiv teilenden und expandieren Zellen (Bürstenbinder et al., 2017; Mitra et al., 2019). Gezielte phänotypische Untersuchungen in Geweben mit endogener IQD-Expression führten zur Identifizierung von ersten Phänotypen in iqd-Knockout-Linien, die auf Funktionen von IQD-Proteinen in der Regulation von Mikrotubuli-Organisation und Zellulosedeposition während der Morphogenese von Blattepidermiszellen hindeuten (Mitra et al., 2019). Im Rahmen aktueller Arbeiten wird die phänotypische Charakterisierung von iqd- und klcr-Knockout-Linien durch molekular- und zellbiologische, sowie durch physiologische Untersuchungen komplementiert. Zentrale Fragestellungen behandeln folgende Inhalte:
- Funktion von IQD-Proteinen am Mikrotubuli-Zytoskelett
- IQD-vermittelte Regulation der Zellwandzusammensetzung
- Identifikation und Charakterisierung von IQD-interagierenden Proteinen
- Kalzium-CaM abhängige Regulation von IQD-Funktionen
- Rolle von IQDs im zellulären Crosstalk zwischen Signalwegen (Kalzium, Phytohormone, Kinasen)
Projekt 2: Struktur-Funktionsanalysen
IQDs sind die größte bekannt Klasse von CaM-Zielproteinen in Pflanzen. Ihre charakteristische IQ67-Domäne besteht aus jeweils mehreren, teilweise überlappenden Kopien (1-4x) von Kalzium-unabhängigen (IQ-Motiv) als auch Kalzium-abhängigen (1-5-10 und 1-8-14) CaM-Interaktionsmotiven, die in definiertem Abstand zueinander angeordnet sind. Rekombinante IQD-Proteine interagieren in vitro sowohl mit Kalzium-freiem apoCaM als auch mit Kalzium-gebundenem holoCaM, was auf eine Funktionalität der verschiedenen annotierten Motive hindeutet (Bürstenbinder et al., 2013; Mitra et al., 2019). Obwohl IQD-Proteine mit berechneten molekularen Massen von 12-90 kDa strukturell sehr unterschiedlich sind, zeichnen sie sich durch eine Reihe gemeinsamer physiko-chemischer Eigenschaften aus, wie z.B. einem basischen isoelektrischer Punkt (pI~10.3) und großen Bereichen mit vorhergesagter intrinsischer Unordnung. Die Bereiche vorhergesagter intrinsischer Unordnung sind durch kurze IQD-spezifische Motive unbekannter Funktion unterbrochen (Abel et al., 2013; Bürstenbinder et al., 2017). Die vier phylogenetischen Gruppen der Arabidopsis-IQD-Familie unterscheiden sich hauptsächlich in der Anordnung und dem Vorhandensein der IQD-spezifischen Motive, die möglicherweise Gruppen-spezifische Funktionen vermitteln, wie z.B. die Interaktion mit spezifischen Proteinen. Erste Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von N- und C-terminal verkürzten IQD-Fragmenten deuten auf Funktionen polybasischer Bereiche in der Vermittlung von Mikrotubuli-Bindung sowie Plasmamembran-Assoziation hin, möglicherweise über elektrostatische Interaktion mit negativ geladenen Resten in Tubulin-Mikrotubuli-Untereinheiten bzw. Kopfgruppen von Membranlipiden. In aktuellen Arbeiten untersuchen wir strukturelle Eigenschaften von IQD-Proteinen, sowie die molekularen Mechanismen der Interaktion mit CaMs, KLCRs und weiteren interagierenden Proteinen (Bürstenbinder et al., 2013), um Einblicke in die molekularen Mechanismen der IQD-Funktion zu erlangen. Inhaltliche Schwerpunkte sind hierbei:
- Strukturanalysen von ausgewählten IQD Proteinen
- Kartierung der CaM-Interaktionsdomänen und Stöchiometrie von IQD-CaM Komplexen
- Einfluss von CaM auf die Interaktion von IQDs mit weiteren Proteinen
- Untersuchungen zur Funktion der IQD-spezifischen Motive in Protein-Protein-Interaktionen und in der Vermittlung subzellulärer Lokalisation
- Regulation von IQD Funktionen über posttranslationale Modifikationen
Projekt 3: Entwicklung von bioinformatischen Tools für die automatische Bildanalyse
Mit Hilfe vom modernen zellbiologischen Methoden können in kurzer Zeit große Datenmengen generiert werden, die für vergleichende Untersuchungen zur Verfügung stehen. Um eine unbefangene und schnelle Bild- und statistische Auswertung zu ermöglichen, arbeiten wir in Kooperation mit Informatikerinnen und Bioinformatikerinnen der MLU Halle-Wittenberg sowie des Deutschen Zentrums für integrative Biodiversitätsforschung (iDiv) an der Generierung von bioinformatischen Tools. Hauptziel unserer Arbeiten ist die Entwicklung von Nutzer-freundlichen Open-Source-Tools für die Batch-Prozessierung von großen Bild-Datensätzen, die wir der wissenschaftlichen Gemeinschaft im Rahmen des ImageJ Plugins Microscopy Image Analysis Toolbox (MiTiBo, http://mitobo.informatik.uni-halle.de) zur Verfügung stellen. Zur grafischen Visualisierung und statistischen Analyse der Daten entwickeln wir zusätzliche R-Skripte. Die bisher veröffentlichten Tools sind PaCeQuant, ein Tool für die automatische Zellformanalyse (1, 2) und CytoskeletonAnalyzer2D, das die Quantifizierung globaler Muster der Mikrotubuli-Organisation in komplex-geformten Zelltypen ermöglicht (3, 4, 5). Im Rahmen aktueller Forschungsprojekte stehen:
- Optimierung und Erweiterung bestehender Tools
- Entwicklung neuer Tools und Funktionalitäten (nach Bedarf)
Referenzen zu Projekt 3:
1 Möller B*, Poeschl Y, Plötner R, Bürstenbinder K.* (2017) PaCeQuant: A tool for high-throughput quantification of pavement cell shape characteristics. Plant Physiol 175(3): 998-1017.
3 Bürstenbinder K*, Möller B, Plötner R, Stamm G, Hause G, Mitra, D, Abel S. (2017) The IQD family of calmodulin binding proteins links calcium signaling to microtubules, membrane subdomains, and the nucleus. Plant Physiol 173:1692-1708.
5 Möller B, Poeschl Y, Klemm S, Bürstenbinder K.* Morphological analysis of leaf epidermis pavement cells with PaCeQuant. Springer. Plant Cell Morphogenesis – Methods and Protocols 2nd edition.
